謝謝各位高手給我很多建議

還有包括ptt上寄信給我的幾位朋友

真的是非常感謝


我有針對大家給的建議然後作一些修正

看圖比較清楚:

2.JPG

 

溫度提高,Betaine濃度增加,major band就跑出來啦~



所以我的實驗總算可以繼續下去了。 (呼~)

最後還是要謝謝每個人不吝嗇的給我意見。

真的非常感謝。

 

科學界果然是處處有溫情啊~


 



1.JPG

 

 


我先前有去NCBI做electronic PCR


測試設計的primer專一性


至少目前看起來這對Primer確實可以夾出我要的geneX,


而且專一性高,在genome database裡沒有其他hit。



 




在genome上的這段序列是high GC content

所以gradient PCR中間的annealing step 我用比較高的溫度

結果失敗。沒有東西。

 2.JPG 




3.JPG
 
然後我又另外加了betaine(5M) 1 uL
 
DMSO濃度不變 只有1%

Gradient PCR範圍拉大  從55~67度

結果只有前面大約55~58左右有PCR產物出現

可是卻沒有我要的PCR產物 (大小約463bp)




 4.JPG 

後來我突然想到PTT上"生命科學核心實驗室"版看看有沒有人有這問題

搜尋文章後發現先前有人建議

若GC比例高(60~70%)  DMSO濃度可以升高到7.5~10%

然後我就試了這個條件

結果還是失敗  整塊膠超乾淨的  只看到marker跑的超漂亮...=___="



* 最亮那條marker是500bp

* PCR program:

 

1. 95'c, 10min

2. 95'c, 45sec

    55~67'c, 1min

    72'c, 30sec

            (29cycles)

3. 72'c, 10min

        4. 4'c, 10min

*Taq和dNTP還有Genomic DNA理論上都沒有壞

  因為跑其他組Primer都沒有問題。




如果有人可以給我建議

 

請問我現在應該更改什麼條件會比較好?

改DMSO濃度?

改Betaine濃度?

改PCR條件?


 

謝謝各位了。



 

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算了

hshinyi 發表在 痞客邦 PIXNET 留言(5) 人氣()


留言列表 (5)

發表留言
  • Davince
  • 你的primer雖然有dimer但是gradient PCR應該總可以試出..

    國外的論壇(protocol-online.org)
    也有人在p G+C rich的地方有類似的問題..
    原作者最後是找特別p GC rich用的polymerase才p出來..

    他之前也嘗試過用formamide、DMSO之類的東西
  • BBEN
  • 加我的即時通或MSN blove1314520yahoo .comn.tw or blove1314520HOTMAIL .com我也在做這個不過我的GC比比你更高 76%
  • 小宇
  • 想請問大大~~之後是改哪些條件後P出來的???
  • 路過
  • 你好
    我也正嘗試以PCR在>70%GC CONTENT的genomic DNA裡製造一條2.9kb的pcr fragment... 試了6/7種enzyme都是不行
    剛好看到你的問題
    所以想問一下你的primer Tm是多少呢?
    我的PRIMER只有55度
    不知道可不可以用你的解決方法??
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