算了

謝謝各位高手給我很多建議

還有包括ptt上寄信給我的幾位朋友

真的是非常感謝


我有針對大家給的建議然後作一些修正

看圖比較清楚：

溫度提高，Betaine濃度增加，major band就跑出來啦～



所以我的實驗總算可以繼續下去了。 (呼～)

最後還是要謝謝每個人不吝嗇的給我意見。

真的非常感謝。

科學界果然是處處有溫情啊～


 

我先前有去NCBI做electronic PCR


測試設計的primer專一性


至少目前看起來這對Primer確實可以夾出我要的geneX,


而且專一性高,在genome database裡沒有其他hit。



 

在genome上的這段序列是high GC content

所以gradient PCR中間的annealing step 我用比較高的溫度

結果失敗。沒有東西。

  

 
然後我又另外加了betaine(5M) 1 uL
 
DMSO濃度不變 只有1％

Gradient PCR範圍拉大  從55～67度

結果只有前面大約55～58左右有PCR產物出現

可是卻沒有我要的PCR產物 (大小約463bp)

  

後來我突然想到PTT上"生命科學核心實驗室"版看看有沒有人有這問題

搜尋文章後發現先前有人建議

若GC比例高(60~70%)  DMSO濃度可以升高到7.5～10％

然後我就試了這個條件

結果還是失敗  整塊膠超乾淨的  只看到marker跑的超漂亮...=___="

* 最亮那條marker是500bp

* PCR program:

1. 95'c, 10min

2. 95'c, 45sec

    55~67'c, 1min

    72'c, 30sec

            (29cycles)

3. 72'c, 10min

        4. 4'c, 10min

*Taq和dNTP還有Genomic DNA理論上都沒有壞

  因為跑其他組Primer都沒有問題。

如果有人可以給我建議

請問我現在應該更改什麼條件會比較好？

改DMSO濃度？

改Betaine濃度？

改PCR條件？


 

謝謝各位了。